本法參照國標(biāo)GB 4789. 3-2010規(guī)定的大腸菌群測(cè)定方法第二法。

⒈檢驗(yàn)程序見圖3-7
 
⒉原理

樣品先經(jīng)過VRBA瓊脂平板的篩選，因其中含有膽鹽和結(jié)晶紫，可以很好的抑制革蘭氏陽性菌的生長，乳糖可以產(chǎn)酸，在中性紅存在時(shí)，產(chǎn)生典型的紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀的菌落。因?yàn)槠渌幮阅c桿菌可以分解其他糖類產(chǎn)生紅色菌落，因此需接種BGLB培養(yǎng)基證實(shí)。

⒊操作步驟

樣品處理及稀釋同MPN法。

①加樣制作平板：選取2-3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌平皿，每皿ImL。同時(shí)取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對(duì)照。及時(shí)將15 -20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注．于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3～ 4mL VRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于（36±1)0C培養(yǎng)18~24h.

②平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在15 ~150CFU的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0. 5mm或更大。

③證實(shí)試驗(yàn)：從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，(36±1)℃培養(yǎng)24-48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。

④大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告：經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以8. 3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（每毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100 X 6/10 X 10-4 CFU/g(mL)＝6. 0 X 10一3 CFU/g（mL)。

⒋檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)

①檢驗(yàn)步驟

2008版前的大腸菌群的檢驗(yàn)步驟采用三步法（乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)、EMB瓊脂分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)）。第一步乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)是樣品的發(fā)酵結(jié)果，不是純菌的發(fā)酵試驗(yàn)，所以初發(fā)酵陽性管，經(jīng)過平板分離和證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可以成為陰性。大量的數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步序的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大，不同食品三步法的符合情況也不一致，所以2008版之后改為兩步法，取消了分離培養(yǎng)這一步，將大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法的培養(yǎng)基由乳糖膽鹽修改為月桂基硫酸鹽胰蛋白膝肉湯；復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基由乳糖發(fā)酵肉湯改為亮綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯，大腸菌群MPN法中報(bào)告每100mL (100g）改為1mL(1g)。試驗(yàn)證實(shí)，修改后對(duì)大腸菌群的檢出效果相同，發(fā)酵管對(duì)于陽性結(jié)果的判斷只通過“產(chǎn)氣”，不存在顏色的影響，明確了判斷依據(jù)；減少了步驟，使操作更加簡(jiǎn)便，結(jié)果更接近真實(shí)。

②產(chǎn)酸產(chǎn)氣原因：在初發(fā)酵試驗(yàn)中，能出現(xiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象的原因很多，如大腸菌群發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；兩種細(xì)菌共同作用發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但其中任何一種不能單獨(dú)發(fā)酵；食品中雜菌多時(shí)，（多黏芽抱桿菌、浸麻芽抱桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌）發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；有些非大腸菌群發(fā)酵葡萄糖等糖類產(chǎn)酸產(chǎn)氣。因此必須做證實(shí)試驗(yàn)。

③復(fù)發(fā)酵結(jié)果：從LST產(chǎn)氣管接一環(huán)到BGLB中進(jìn)行復(fù)發(fā)酵，（此時(shí)不受樣品中非乳糖的干擾進(jìn)行乳糖發(fā)酵，也避免了許多芽抱桿菌的干擾），在BGLB中產(chǎn)氣的為陽性，不產(chǎn)氣的為陰性。但此法也有缺陷，有時(shí)出現(xiàn)假陽性。由于亮綠遇膽鹽降低了其活性，有時(shí)不能徹底抑制芽抱菌。為避免此缺陷，對(duì)BGLB中產(chǎn)氣的劃線于EMB上，挑典型菌落鏡檢。

④抑菌劑：在大腸菌群檢驗(yàn)中，經(jīng)常使用的抑菌劑有膽鹽、洗衣粉、十二烷基磺酸鈉、亮綠、結(jié)晶紫、孔雀綠等。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群的生長和挑選，但對(duì)大腸菌群中的某些菌株有時(shí)也產(chǎn)生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱量時(shí)稍有誤差，即可對(duì)抑菌作用產(chǎn)生影響；有的抑菌劑當(dāng)牌號(hào)、規(guī)格改變時(shí)，也可影響抑菌效果，而需重新測(cè)定抑菌的有效劑量，這些情況均給抑菌劑的使用帶來不利條件。目前我國在食品大腸菌群檢驗(yàn)方面采用膽鹽作為抑菌劑，豬、牛、羊三種膽鹽對(duì)大腸菌群的檢驗(yàn)效果，經(jīng)試驗(yàn)觀察無明顯差異，可相互替代，但其他膽鹽的檢驗(yàn)效果則不一致，故不宜相互替代。

目前由于膽鹽不易購買，有的實(shí)驗(yàn)室以3號(hào)膽鹽、混合膽鹽、去氧膽酸鈉、兔膽鹽等替代豬膽鹽加入培養(yǎng)基中，這會(huì)影響大腸菌群的檢驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)予注意。因此在2008版的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中改為月桂基硫酸鈉。兩者的作用都是抑制革蘭氏陽性球菌。但前者是化學(xué)試劑，批間差異小，易觀察結(jié)果，對(duì)損傷菌有修復(fù)作用，檢出率提高，檢驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。后者是生物試劑，取自牛和豬等動(dòng)物的膽囊，批間差異大，結(jié)果可靠性差。另外，在膽鹽用量上實(shí)驗(yàn)表明1%, 0.5％和0. 25％三個(gè)劑量無任何差異，所以目前乳糖發(fā)酵管采用的膽鹽劑量（(0. 5%)是適宜的，在稱量時(shí)稍有誤差，亦不致影響大腸菌群的檢出。

⑤平板計(jì)數(shù)法：若樣品較臟，使用MPN法較不方便，一般使用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）在平皿內(nèi)樣品稀釋液與VRBA瓊脂混合，等到凝固后，另加蓋一層VRBA瓊脂，以抑制專性需氧菌，從中挑取粉紅暈的菌落計(jì)數(shù)，取30~150個(gè)菌落的平板，挑選其中10個(gè)有代表性的菌落分別接種到亮綠膽鹽發(fā)酵管進(jìn)行鑒定。

⑥挑選菌落：大腸菌群是一群腸道桿菌的總稱，大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸埃希氏菌類更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。所以在實(shí)際工作中，為了提高大腸菌群的檢出率，應(yīng)當(dāng)熟悉大腸菌群的菌落色澤和形態(tài)。在檢驗(yàn)中，大腸菌群在VRBA瓊脂上典型菌落呈紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0. 5mm或更大。在伊紅一美藍(lán)（EMB)平板上的菌落呈黑紫色有光澤或無光澤的檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。菌落形態(tài)的其他方面（如菌落大小、光滑與粗糙、邊緣完整情況、降起度、濕潤與干燥等）雖亦應(yīng)注意，但不如色澤方面更為重要。影響大腸菌群檢出率的因素較多，如食品種類、菌落色擇和形態(tài)、細(xì)菌種類等，所以實(shí)際工作中通常挑選一個(gè)菌落，由于概率問題，難免出現(xiàn)假陰性，尤其當(dāng)菌落不典型時(shí)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則多挑幾個(gè)，以免出假陰性。

⑦產(chǎn)氣量：大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生小于米粒的氣泡。一般來說，產(chǎn)氣量與大腸菌群檢出率呈正相關(guān)，但隨樣品種類而不同，有小于米粒的氣泡，亦可有陽性檢出。對(duì)未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管如有疑問時(shí)，可用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)做進(jìn)一步觀察。這種情況的陽性檢出率可達(dá)半數(shù)以上。
⑧MPN法：MPN法是一種采用數(shù)學(xué)理論推算，用置信區(qū)間描述細(xì)菌濃度的一種間接計(jì)數(shù)法。雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果以MPN值表示，但MPN值并不能表示實(shí)際菌落數(shù)，而實(shí)際菌落數(shù)落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點(diǎn)。該方法是1915年McCrady首次發(fā)表的。

最可能數(shù)（MPN）是表示樣品中活菌密度的估測(cè)。MPN檢索表通常是采用三個(gè)稀釋度九管法來計(jì)算的，當(dāng)然也可以十五管或更多。稀釋度的選擇是基于對(duì)樣品中菌數(shù)的估測(cè)，較理想的結(jié)果應(yīng)是最低稀釋度3管為陽性，而最高稀釋度的3管為陰性。如果無法估測(cè)樣品中的菌數(shù)，則做一定范圍的稀釋度。這次提供的MPN檢索表列出了95％可信限，供作參考。

另外，在查閱MPN檢索表時(shí)，應(yīng)注意以下幾不問題。

通常MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，即0.1mL(g), 0.O1mL(g), 0.OO1mL(g)，如欲改用1mL(g)、0. 1mL(g)、0. 01mL(g）或0. 01mL(g)、0. 001mL(g)、0. 0001mL(g）時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加或降低10倍，其余可類推。

在MPN檢索表第一欄陽性管數(shù)下面列出的mL (g)，系指原樣品（包括液體和固體）的毫升（克）數(shù)，并非樣品稀釋后的毫升（克）數(shù)，如固體樣品lg經(jīng)10倍稀釋后，雖加人1mL量，但實(shí)際其中只含0. 1 g樣品，故應(yīng)按0. 1g計(jì)，不應(yīng)按1mL計(jì)，或按1mL計(jì)，單檢索數(shù)字必須再乘以稀釋倍數(shù)。

當(dāng)檢索表內(nèi)三個(gè)稀釋度檢測(cè)結(jié)果都是陰性時(shí)，MPN值應(yīng)按＜3判定，這樣更能反映實(shí)際情況。例如11. 1mL(g）和1. 11mL(g）兩個(gè)檢測(cè)劑量，當(dāng)它們都是陰性時(shí)，如按。處理，則兩組樣品雖相差10倍，但MPN值卻無法區(qū)分，實(shí)際上這兩個(gè)。的含義并不相等。如按照＜3和＜30處理，則MPN值能反映出兩組所用樣品量的不同，實(shí)際上11. 1mL(g）應(yīng)為G3，而1. 11mL(g）應(yīng)為＜30，二者還是有區(qū)別的。所以用＜3和＜30處理，更能反映實(shí)際情況。